Dpph là gì

     
*

Nguyên tắc của phương phápCách trộn hóa chấtTiến hành bội phản ứngCông thức tính kết quảCác để ý cơ bảnTài liệu tham khảo


NGUYÊN TẮC

Phương pháp xác định kỹ năng bắtgốc tự do thoải mái DPPHᐧ (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) được phát triển bởi Blois <1>. So sánh này dựa vào sự thay đổi màu của hỗn hợp DPPH. DDPH﮲ là nơi bắt đầu tự do màu sắc bền lâu tím, gồm điện tử chưa ghép song trên nguyên tử nito chế tác thành khối hệ thống liên hợp năng lượng điện tử. Electron tự do thoải mái của phân tử nito trong DDPH﮲ lúc bắt cặp với cội hydro từ chất kháng oxyhóa làm mất đi màu tím đặc trưng của gốc tự do DDPH﮲ trongdung dịch methanol. Khả năng khử cội DDPH﮲ của một hóa học kháng lão hóa thể hiện ở tầm mức độ làm sút màu của dung dịch DDPH, được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λmax = 517 nm. Phụ thuộc đường chuẩn chỉnh xác định quý hiếm IC50 <2>.

Bạn đang xem: Dpph là gì

PHA HÓA CHẤT

1.Pha dung dịch DPPH

Cân 0.0056g DPPH hòa trong 5mL Methanol thuần khiết → hỗn hợp DPPH 30mM (stock 10X), bảo vệ nhiệt độ lạnh, bọc bí mật bằng giấy bạc.

Khi làmthí nghiệm, trộn loãng stock 10X → 1X (3mM)

2.Pha mẫu đề nghị phân tích

Đối với mẫu mã dạng rắn (cao chiết/ bột):

-Xác định dung môi nhằm hòa chảy mẫu. Lấymột không nhiều mẫu, hòa trong những dung môi khác biệt (nước, methanol, ethanol, acetone,DMSO,… ). Quan gần cạnh lựa lựa chọn dung môi nào có khả năng hòa tan trọn vẹn mẫu cầnphân tích. Nếu sẽ biết mẫu của bản thân mình hòa tung trong chất nào rồi, các bạn có thểbỏ qua cách này.

-Hòa rã 1000 ug mẫu mã vào 1 mL dung môi, chiếm được dung dịch gồm nồng độ 1000ppm.

-Pha loãng bậc 2 liên tục (two-foldserial dilution) thành dãy những nồng độ không giống nhau và giới hạn ở khoảng nồng độ tự 5 –10 ppm.

Đối vớimẫu so sánh dạng lỏng (dịch chiết):

-Định lượng chất phải phân tích trongdịch tách và tùy theo chất của các bạn là nhiều loại hợp chất gì, sẽ sở hữu được những phươngpháp định lượng không giống nhau. Ví dụ, chúng ta có dịch chiết từ cải bắp tím và muốn phântích hoạt tính của hợp hóa học anthocyanin trong dịch chiết, bạn sử dụng phươngpháp “pH Vi Sai” để xác định dịch chiết lúc đầu có lượng chất anthocyanin là baonhiêu ppm.

-Từ dịch tách ban đầu, pha loãng bậc2 liên tục (two-fold serial dilution) thành dãy các dịch phân tách ở độ trộn loãngkhác nhau (nên có tác dụng từ 7 – 10 lần trộn loãng). Ở cách này, thực hiện dung môi táchchiết mẫu để trộn loãng mẫu.

-Từ các chất chất có trong dịch chiếtban đầu, xác định hàm lượng chất phải phân tích vào dịch chiết ở mỗi bậc phaloãng.

3.Pha đối chứng

Nếu thực hiện đối triệu chứng dương là vitamin C, pha hàng nồng độ từ 0 → 30 ppm, sử dụng dung môi là nước(Vitamin C tan giỏi trong nước)

Nếu sử dụng những đối bệnh khác, cân 100 ug chất đối bệnh và hòatan trong dung môi, tiếp nối pha loãng bậc 2 về khoảng chừng nồng độ 0 – 5 ppm.

TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG

Trong một giếng của đĩa 96 thêm lần lượt các thành phần sau:

·100 μl mẫu phân tích/đối chứng/dung môi

·100 μl DPPH 3 milimet / methanol

→ phản ứng khoảng 30 phút trong tối, đo tỷ lệ quang tại bước sóng 750nm

Bảng sắp xếp thí nghiệm

Mẫu phân tích

Mẫu trắng

Mẫu đối bệnh dương

Mẫu đối bệnh âm

Dung dịch DPPH

x

x

x

Mẫu phân tích

x

x

Chứng dương (Vitamin C)

x

Methanol

x

Dung môi

x

CÔNG THỨC TÍNH

Phần trăm gốc tựdo DDPH﮲ được tínhtheo công thức:


*

Chú thích

SCDPPH﮲ : năng lực bắt gốctự vì chưng DDPH﮲ (%)As : Độ hấp thụ quang của mẫu phân tíchAb : Độ hấp thu quang của chủng loại trắngAn : Độ hấp thu của mẫu đối bệnh âm

Tính quý hiếm IC50 của chủng loại thử và chủng loại đối chứng nhờ vào phương trình tuyến đường tính thân nồng độ với % hoạt tính bắt gốc tự do thoải mái của chúng, theo công thức sau:


*

Chú thích

IC50 : Nồng độ mẫu thử, chuẩn chỉnh có thể bắt được 1/2 gốc tự do DDPH﮲a, b : lần lượt là độ dốc và hệ chắn của phương trình tuyến tính giữ lại nồng độ với % bắt gốc tự do.

Mẫu được thựchiện lặp lại ba lần và tác dụng được màn biểu diễn dưới dạng cực hiếm trung bình ±SD

LƯU Ý

Có thể pha tùy ý nồngđộ DPPHᐧ, chỉ cầnđảm bảogốcDPPHᐧ trong phản nghịch ứng luôn luôn dư. Tuy vậy vậy, mình ko khuyến khích chúng ta pha hỗn hợp DPPH ởnồngđộ quá cao, vì chưng lúc nàymàu của dung dịch DPPH khôn cùng đậm, tất cả thểkhó quan ngay cạnh sự thayđổi của màu sắc trước và sau phản bội ứng trong một số trong những trường hợp.

Xem thêm: Sự Thật Thú Vị Về Cỏ 4 Lá Thường Mọc Ở Đâu, Cỏ 4 Lá Mọc Ở Đâu

Dung dịch DPPH nhạy bén với ánh sáng, dễ dẫn đến oxy hóa, vày vậy các bạn không cần pha thừa nhiều, trường hợp pha dư bao gồm thể bảo vệ ở nhiệt độ lạnh cùng bọc bí mật giấy bội nghĩa để kị ánh sáng, và áp dụng sau 1-2 ngày, tránh việc dùng lúc đã để quá lâu hoặc quan giáp thấy màu sắc nhạt đi đối với ban đầu.

Mẫu đối bệnh âm là mẫu mã quan trọng, chúng ta nên lặp lại nhiều lần mẫu mã này vào một mẻ thử nghiệm (trên 3 lần) để rất có thể có số liệu chính xác nhất.

Mẫu trắng quan trọng trong ngôi trường hợp hóa học phân tích của doanh nghiệp có màu, đặc biệt là những chất có màu sắc gần tương đương với màu của dung dịch DPPH (anthocyanin, astaxanthin,... ). Đối với ngôi trường hợp mẫu mã không màu cùng trong suốt, các bạn cũng có thể bỏ qua mẫu mã trắng.

Mẫu phân tích cần phải hòa tan trả toàn, nếu như là dịch tách thì dịch phân tách cần đồng điệu và không có cặn bẩn. Nếu đề nghị thiết, các chúng ta có thể sử dụng filter 0.45 um để lọc mẫu trước khi phân tích.

Dung dịch sau phản nghịch ứng nhằm đo OD phải đồng nhất, không tồn tại bọt khí (dễ xẩy ra khi làm mẫu vitamin C). Vào trường phù hợp này hoàn toàn có thể dùng đầu tip hoặc tăm nhằm khuấy nhẹ, loại bỏ bọt khí.

Khi thêm những thành phần bội nghịch ứng vào tô 96 hoặc ống nghiệm, hỗn hợp DPPH rất cần phải thêm sau cùng, và bảo vệ tránh ánh sáng nhiều nhất bao gồm thể. Đối cùng với đĩa 96 các bạn cũng có thể cố gắng thao tác nhanh. Đối cùng với ống nghiệm, các bạn có thể bọc lại bởi giấy bạc. để phản ứng ra mắt ở nới không có ánh sáng. Sau thời gian phản ứng, kết quả cần được đo ngay, không nhằm lâu xung quanh ánh sáng.

Phần kết quả, các chúng ta có thể nhập vào excel với tính toán bằng tay theo công thức mình đã trình bày, hoặc rất có thể sử dụng một số phần mềm thông dụng để có được công dụng nhanh hơn nhé. Ở đây, mình đề xuất một phần mềm thân quen là Graphpad Prism.

THAM KHẢO

1.Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable miễn phí radical. Nature.1958;181(4617):1199.

Xem thêm: Top 5 Bài Phân Tích Đoạn 1 Trong Bình Ngô Đại Cáo Hay Chọn Lọc

2.Kedare SB, Singh R. Genesis and development of DPPH method of antioxidantassay. Journal of food science & technology. 2011;48(4):412-422.